PCR常見問題
圣賓儀器科技上海有限公司
問題1：假陰性（無擴增產(chǎn)物）
現(xiàn)象：正對照有條帶，樣品無條帶
可能原因：
模板：含有Taq酶抑制劑、雜蛋白，模板上樣量低或模板降解
引物：引物降解，引物設計不合理
試劑：酶失活，buffer不合適
反應條件：退火溫度高，延伸時間短
解決方法：
純化模板并重新提取，并檢測模板是否含有抑制劑
重新設計引物并低溫保存
優(yōu)化buffer，摸索鎂離子濃度或適當加入DMSO（小于0.3%）
降低退火溫度，增加延伸時間（反應條件參照試劑盒說明書）
問題2：假陽性
現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)條帶
可能原因：
引物設計不適，與目的序列具有同源性
試劑污染：水、移液槍等被核酸污染
樣品間出現(xiàn)交叉污染
解決方法：
實驗儀器高壓滅菌
實驗試劑（酶除外）高壓滅菌，離心管槍頭一次性使用
規(guī)范實驗操作
假陽性可通過巢式PCR解決，或者使用特異性較高的試劑盒擴增
問題3：拖尾、彌散
現(xiàn)象：電泳出現(xiàn)拖尾、涂抹帶
可能原因：
酶用量過多
模板純度較低
dNTP、鎂離子濃度過高
循環(huán)次數(shù)過多
解決方法：
減少用酶量或使用特異性高的熱啟動酶擴增
純化模板
減少dNTP用量，摸索鎂離子濃度
減少循環(huán)次數(shù)
問題4：二聚體及非特異性產(chǎn)物
一般小于100bp的條帶可基本判斷為引物二聚體
主要原因：
引物設計不合理，引物自身具有互補性
引物濃度不適
鎂離子濃度過高，退火溫度過低
解決方法：
重新設計引物并進行BLAST檢測
降低鎂離子濃度，提高退火溫度
增加模板用量
提高PCR反應特異性的方法
引物的設計
引物在模板cDNA的保守區(qū)設計，長度15-30bp，GC含量小于60%，3’端不超過連續(xù)三個G或C，堿基分布錯落有致，避免引物自身形成二聚體，設計完成之后，需進行BLAST檢測，如果與其他基因不具有互補性，則可以進行下一步實驗。
降落PCR
降落PCR是一種簡單的降低非特異性產(chǎn)物的PCR的優(yōu)點就是可以降低實驗耗時，同時又可以優(yōu)化實驗的步驟。引物的設計決定退火溫度，退火溫度過高會使PCR效率過低，過低則會使非特異擴增過多。這雖然可以通過反復嘗試來優(yōu)化，但費時費力。降落PCR提供了一個較為簡易的優(yōu)化方法。先在較高的溫度下擴增，此時雖然擴增效率低，但非特異擴增基本沒有。隨著退火溫度的降低，非特異擴增會逐步增多。但由于此時特異的擴增產(chǎn)物已經(jīng)達到一定的數(shù)量優(yōu)勢，因此會對非特異擴增產(chǎn)生強烈的競爭抑制，從而大幅提高PCR的特異性和效率。
熱啟動擴增
采用熱啟動方法進行擴增，是除了設計引物之外，提高PCR反應特異性的方式。在一般的PCR反應中，試劑的配置需在冰上進行，且要將PCR儀預熱，這種方法就類似于熱啟動，能夠一定程度的抑制錯配。但是酶在低溫下也存在活性，只要體系中有DNA鏈存在，就會擴增產(chǎn)生非特異性條帶。采用熱啟動的方法就是在達到變性溫度之抑制酶的活性，而有效的方法就是使用熱啟動酶或高保真酶去擴增，它的原理就是采用化學修飾的方法封閉酶的活性中心，當溫度上升到95℃時恢復活性，指導擴增。
巢式PCR
采用巢式PCR進行擴增，在多輪擴增結果中提高擴增特異性和靈敏度。與普通PCR不同的是，它采用兩對引物進行擴增，先用對引物普通PCR，然后將輪擴增的產(chǎn)物稀釋100倍后用第二對引物（巢式引物）二次擴增。因此采用巢式PCR可以大大增加困難模板擴增的特異性和有限靶序列的靈敏度。
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