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MTT比色法注意事項(xiàng)

點(diǎn)擊次數(shù)：6729 發(fā)布時(shí)間：2021/8/9 11:25:14

MTT比色法注意事項(xiàng)

圣賓儀器科技上海有限公司

注意事項(xiàng)

1. 選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度和培養(yǎng)時(shí)間。

2. 設(shè)置調(diào)零孔（只加培養(yǎng)基100ul、MTT10ul、二甲基亞砜100ul）。

3. 設(shè)置空白孔（細(xì)胞、藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液共100ul、10ulMTT 、100ul二甲基亞砜）。

4. MTT實(shí)驗(yàn)吸光度zui后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線(xiàn)關(guān)系。

5. 96孔板邊緣32孔用無(wú)菌PBS填充，因?yàn)檫吘壍?2孔中水分蒸發(fā)很快，藥物易被濃縮，對(duì)實(shí)驗(yàn)影響大。同時(shí)加入PBS液填充后，可以一定程度上保持中間孔的水分。

6. 防止藥物與MTT反應(yīng)。

如果96孔板中加入了具有氧化還原性的藥物，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建議用PBS將細(xì)胞洗洗，否則這些藥物會(huì)將MTT還原成棕褐色沉淀，這種效果可能是不需要的。

7. 吸收值分析

在理想的MTT實(shí)驗(yàn)中，如果是細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)，不加藥物處理的空白組的吸收值應(yīng)該在0.8-1.2左右，太小檢測(cè)誤差占的比例較多，太大吸收值可能已經(jīng)超出線(xiàn)性范圍。這個(gè)原理在朗伯-比爾定律中有解釋。

8. 培養(yǎng)過(guò)程中換液

100ul的培養(yǎng)液對(duì)于10的4～5次方的增殖期細(xì)胞來(lái)說(shuō)，很難維持50h以上，如果營(yíng)養(yǎng)不夠的話(huà)，細(xì)胞會(huì)由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果。如果培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，在48h應(yīng)該換液一次。

9. 避免血清干擾

高的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會(huì)試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10％胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。

10. 判斷污染

如加入MTT后都有個(gè)別孔立即變?yōu)樗{(lán)黑色，則污染的可能性極大。在加MTT可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的。

11. 加DMSO要把液體小心吸掉

但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能會(huì)吸去，可在這之先用平板離心機(jī)離心96孔板，2000r，5分鐘，然后吸掉上清(如果是懸浮細(xì)胞，則推薦此法，懸浮細(xì)胞要離心2500rpm×10min.且其做MTThao用圓底型96孔板，清除上清時(shí)注意不要把下面的結(jié)晶顆粒吸掉。對(duì)于貼壁細(xì)胞，可以試著將96孔板傾斜30度角，然后用槍尖慢慢吸。

12. MTT法只能用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候，為了baozheng實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線(xiàn)性，MTT 吸光度zui好在0-0.7 范圍內(nèi)。MTT一般zui好現(xiàn)用現(xiàn)配，過(guò)濾后4ºC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度chang期保存，避免反復(fù)凍融，zui好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒(méi)必要一下子配那么多，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用了。MTT有致癌性，用的時(shí)候小心，有條件zui好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無(wú)菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒(méi)有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉。
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